| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 309-1 | ||||
Resumo:Os anticorpos monoclonais provocaram uma revolução no tratamento de diversas patologias humanas desde a introdução do primeiro anticorpo o Muromonab CD3 em 1986, ao longo dos anos subsequentes muitos avanços ocorreram fazendo com que os anticorpos tornassem um sucesso e assim contando com um portfólio de diversos fármacos. Atualmente a maior parte desses medicamentos são produzidos em plataformas de células animais, tendo as células do ovário de hamster chinês (CHO) como a principal. Apesar do enorme sucesso os anticorpos ainda enfrentam muitos obstáculos, sendo o alto custo para sua produção um ponto de destaque. A busca por plataformas alternativas fez se necessário para que a produção desses fármacos se torne mais acessível, partindo desse princípio no presente estudo o objetivo deste trabalho foi expressar o gene que codifica para a proteína Adalimumabe em duas regiões distintas de homologia do genoma do cloroplasto (psbH e psbA), com gene de interesse regulado por promotores distintos (psbD e psbA) e acumular o fármaco na respectiva organela da microalga verde Chlamydomonas reinhardtii. Para isso os vetores de expressão psbA e psbH contendo a sequência do gene de interesse (Adalimumabe) foram transformados nas cepas CC400 e CC503 da C. reinhardtii pela técnica de transformação de perolas de vidro. O meio seletivo contendo canamicina foi usado para selecionar as colônias transformadas, seguido de PCR convencional para confirmação de gene positivo e homoplasmia e posteriormente ensaios de Western blot (WB) para confirmar o acúmulo de proteína. Foram obtidas colônias transformadas para o vetor do psbA na cepa CC5003 e para o vetor do psbH na cepa CC400, as colônias transformadas foram detectadas em placas de ágar contendo o antibiótico canamicina. A presença do gene de interesse foi confirmada pela técnica de PCR. Após sucessivas passagens das colônias, oito colônias do vetor psbA e dez colônias do vetor psbH apresentaram homoplasmia pela técnica de PCR, entretanto seis colônias do vetor psbA e oito colônias do vetor psbH apresentaram detecção de produto recombinante (aglomerado) após o ensaio de WB, sendo mantida posteriormente em cultura duas colônias de cada vetor que apresentaram maior acumulo por quantificação relativa em WB. Quando comparado o acúmulo do aglomerado nos dois sítios, observou-se que houve um maior acumulo no vetor do psbH em relação ao vetor do psbA, também observou-se uma diferença na coloração entre as culturas quando cultivadas por cinco dias. Como conclusão, no presente estudo conseguimos detectar o gene que codifica a proteína de interesse nas duas regiões distintas do genoma estudado, consequentemente observamos o acumulo da proteína na Chlamydomonas reinhardtii. Apesar dessa proteína estar formando um aglomerado, essa formação de aglomerado pode ser em decorrência da escolha da organela, uma vez que no cloroplasto a glicosilação é ausente, gerando assim um anticorpo aglicosilado, esse por sua vez é mais propensos ao acumulo de agregados devido as suas caraterísticas bioquímicas. O acumulo e a diferença de cor entre as culturas pode estar relacionado ao knockout do gene psbA, que por sua vez impede a síntese da proteína D1 do fotossistema II e que é essencial para a atividade fotossintética, logo a ocorrência de biossíntese é dependente da disponibilidade de fonte de carbono em meio de cultura, já na região do psbH a inserção do vetor de expressão não resulta em deleção de genes ou parte do genoma. Palavras-chave: Engenharia genética, Proteína recombinante, Alga, Adalimumabe Agência de fomento:CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior | |||||